Cara tindakannya adalah dengan menghalang sintesis protein dengan mengikat subunit ribosom 30S mikroorganisma yang mudah terdedah kepada
oksitetrasiklin, dengan itu
menghalang hubungan antara ribosom dan aminoasil-tRNA. Ia juga dipercayai bahawa oksitetrasiklin bersambung secara songsang dengan ribosom 50S dan mengubah kebolehtelapan membran sitoplasma mikroorganisma sensitif. Oksitetrasiklin, pada kepekatan yang tinggi, juga boleh menghalang sintesis protein dalam sel.